哺乳动物诱导多功能干细胞

诱导型多能干细胞 (induced pluripotent stem cells, iPS细胞) 是通过在体细胞中转入几个特定的转录因子, 实现体细胞核的重编程而获得的可不断自我更新且具有多向分化潜能的类胚胎干细胞样细胞。2006年Takahashi和Yamanaka[1]从与干细胞多能性维持相关的24个候选因子中筛选出4个转录因子组合Oct3/4、Sox2、c-Myc和KlF4, 利用逆转录病毒转染小鼠胚胎成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞, 成功诱导出小鼠iPS细胞。这一消息在生物学界引起了巨大轰动, 国内外科学家们开始对iPS技术产生极大的兴趣。正是因为iPS细胞与胚胎干细胞有相同的发育潜能, 并且它的获得不需要摧毁早期胚胎, 从而避免引发伦理道德争论, 所以迄今研究iPS细胞的热潮仍在持续, 并且未来有可能替代胚胎干细胞用于临床研究[2]。

1 iPS细胞诱导相关的转录因子

Oct4是胚胎发育多能性相关的转录因子, 属于POU转录因子家族中的一员, 由Pou5f1基因编码产生, 它是全能性的标志, 能够促使内细胞团形成、维持ES细胞未分化前状态并促进其增殖。因此, Oct4在维持干细胞多能性和干细胞的分化命运中起到重要作用[3]。

Sox2是Sox家族成员之一, 也是胚胎发育早期多能性的一个标志基因, 在内细胞团、外胚层和生殖细胞中有表达。Sox2与Oct4一样对于维持干细胞的多能性状态是不可或缺的[4]。

c-Myc是Myc癌基因家族的重要成员之一, 具有增强细胞增殖的能力, 并且促进肿瘤的发生。由于c-Myc具有引起iPS细胞产生肿瘤的风险, 在重编程过程中去除该基因, 结果发现诱导iPS细胞的重编程进程减慢, iPS细胞的形成效率显著降低, 并且推迟iPS细胞克隆的产生[5]。

KlF是属于Kruppel样因子的锌指蛋白, 具有癌基因属性。在ESC自我更新过程中KlF4起着积极的作用, 又有实验表明, Klf4基因对于ES细胞的自我更新和未分化状态的维持并不是必需的, 可以由其他的一些转录因子或小分子取代[6]。

此外, Nanog和Lin28也是重编程过程中用到的转录因子。综上, 实现重编程的4个转录因子中, Oct4一直被认为是重编程过程中不可缺少, 在重编程起始过程中起到重要作用。而Sox2往往作为Oct4的协作因子对ESCs中的下游靶基因进行调控, 二者是维持胚胎干细胞特征所必须的转录因子。而Klf4和c-Myc作为癌基因, 在重编程过程中其可能的作用是使成熟细胞产生肿瘤样转变, 赋予细胞无限增殖以及快速生长的能力, 都可被同一蛋白家族的其它成员所替代, 因此Klf4和c-Myc可能并非是重编程过程所必需的因子。

2 iPS技术的研究进展

继2006年Takahashi[1]首次建立了小鼠iPS细胞以来, iPS的研究虽然发展比较迅速, 但是也存在许多问题和困难, 如病毒介导的转基因可能会整合入宿主细胞的基因组;诱导过程中使用致瘤基因致瘤;诱导iPS细胞的产生效率低等。这些无疑将严重阻碍iPS细胞的实际应用。因此, 如何有效地提高病毒转染的效率和安全性是我们亟待解决的问题。诱导iPS细胞的方法分为以下几种。

2.1 整合方式

2.1.1 逆转录病毒载体

最初是利用逆转录病毒载体[7]表达4个重编程因子, 然后将细胞在ES细胞培养液中培养, 用多能性标志分子Fbx15的表达对转染后的细胞进行筛选, 得到与ES细胞形态相似的克隆体 (即iPS细胞) 后, 这些iPS细胞能够表达ES细胞的特异性标志基因, 将得到的iPS细胞皮下注射免疫缺陷型小鼠可以使其发生含有3个胚层的畸胎瘤, 将iPS细胞注射到小鼠囊胚中也可形成嵌合体, 但是仍然没有得到成活的嵌合体小鼠。这种传统的方法存在诱导效率很低和细胞多能性不均一等不足;并且还存在内在安全问题, 不管是逆转录病毒, 还是慢病毒, 都会把外源基因整合到基因组DNA中, 这就有可能引起宿主基因组的插入突变。由于转录因子中c-Myc和Klf4具癌基因属性, 它们可以使诱导的多功能干细胞后代小鼠形成肿瘤。Nakagawa等[8]尝试了去掉cMyc因子, 只用Oct4, Sox2和Klf43个因子来诱导iPS细胞, 虽然效率有所降低, 但是得到的iPS后代小鼠在出生100d后没有肿瘤形成。最近研究发现一些小分子化合物可以通过调控细胞内源性重编程基因的表达量, 来替代这4种重编程因子中的部分因子行使诱导功能以及提高诱导效率, 如组蛋白脱乙酰基酶抑制剂-丙戊酸 (VPA) , 它可以诱导基因组水平的乙酰化, 促使细胞具有松弛的染色体结构, 这种结构对结合异位表达的转录因子或者下游次级转录因子是有利的, 通过小分子化合物提高重编程效率的同时还可以有助于减少参与重编程所需因子的数量, 能够同Oct4和Sox22种因子一同作用即可诱导原代人成纤维细胞重新编程为iPS细胞[9], 大大降低了iPS细胞的致癌性, 同时使诱导效率提高了100倍。

2.1.2 2A肽段序列和IRES技术

为了提高安全性, 降低病毒的整合效率, Carey等[7]通过引入自剪切多肽2A序列和核糖体进入位点IRES序列, 将转录因子用一个简单的慢病毒载体实现同步表达, 减少了宿主细胞中的病毒载体的数量, 从而降低了插入突变的概率。引入自剪切多肽2A序列是指在4种重编程因子之间分别插入3种不同的2A序列;同时引入2A序列和IRES序列是指在Oct4与Klf4通过F2A连接在一起的顺反子和Sox2与c-Myc通过E2A连接的顺反子之间插入IRES序列。2种方法相比, 仅用自剪多肽2A序列连接的4个转录因子在表达时容易引起下游顺反子较低水平的表达, 而插入IRES序列的多顺反子载体可以克服这种上游与下游顺反子表达量的差异。

2.1.3 Cre/LoxP重组系统

还可以采用Cre/LoxP重组系统来切除整合的外源重编程因子, 以获得iPS细胞[10]。Cre重组酶是一种位点特异性重组酶, 能介导2个LoxP序列之间的特异性重组, 使LoxP位点之间的基因序列被删除或重组。LoxP序列来源于P1噬菌体, 是有2个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成, 8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合, LoxP序列的13bp反向重复序列是Cre酶的结合域。如果2个LoxP序列位于一条DNA链上, 且方向相同, Cre重组酶能有效切除2个LoxP位点间的序列。但尽管如此, 载体的一段DNA还留在插入位点上, 因此仍然无法避免插入突变。

2.1.4 线性化的质粒和piggyBac (PB) 转座子

为了降低插入突变, 可以用线性化的质粒和piggyBac (PB) 转座子介导表达4个重编程因子, 强力霉素诱导并建立iPS细胞系, 然后在这些iPS细胞中瞬时表达可以切除这4种外源重编程因子的转座酶, 诱导产生的iPS细胞就不再表达外源重编程因子, 安全性有所提高。PB转座子两端各有一个连着可以瞬时表达插入或切除功能的转座酶基因的反向重复序列, 具体方法是将4种重编程因子插入到含有四环素或强力霉素启动子的PB-TET转座子质粒中, 转染小鼠胚胎纤维母细胞, 用反式四环素激活蛋白激活诱导iPS后, PB转座子系统翻译表达的转座酶可将外源DNA彻底清除, 并不引起基因组DNA序列的任何变化[11]。相对Cre介导的基因切除而言, PB转座子系统是一种更安全的建立iPS细胞系的方法。

2.2 非整合方式

2.2.1 腺病毒载体

从诱导iPS细胞的分子机制方面来看, 通过导入外源转录因子基因, 其表达产物可激活内源的Oct4、Sox2等转录因子基因, 从而开启基因组的重编程过程, 也就说明iPS细胞无需病毒载体整合进宿主基因组, 只需外源转录因子的瞬时表达, 激活内源性转录因子, 此后iPS细胞多潜能性靠内源性转录因子表达来维持, 而不再需要外源基因的诱导与维持。由于iPS细胞的形成需大约10～12d的持续表达重编程因子, 因此, 对瞬时表达的持续时间要求至少为10d。Stadtfeld等[12]为了避免造成基因组插入突变, 采用腺病毒载体来介导重编程因子的转染小鼠纤维母细胞和肝细胞来诱导iPS细胞, 并成功获得了没有外源基因整合的iPS细胞。

2.2.2 脂质体介导

Okita等[13]采用脂质体介导的转染方法来诱导鼠的胚胎纤维母细胞iPS细胞, 由于质粒载体在细胞培养过程中容易被稀释和退化, 所以设计了2种载体, 一种是含Oct3/4、Sox2、Klf4的多顺反子载体, 另一种是含有c-Myc的单独质粒, 反复交替转染这2种载体, 以保证重编程因子在重编程的前期持续表达, 但诱导iPS细胞的效率很低。此外非整合型附着体载体腺病毒载体也被用于小鼠纤维原细胞和肝脏细胞iPS细胞的诱导, 该方法同样存在效率低的问题。

2.2.3 重组蛋白

上述方法都是对细胞进行了基因水平的操作, 近年来有研究通过导入重编程因子的编码蛋白的方法来诱导iPS细胞的形成。蛋白转导诱导多功能干细胞方法的建立标志着iPS研究的又一重大的突破。转导所用的重编程蛋白是原核表达表达的修饰了的重组蛋白, 即将细胞穿膜肽序列连接到重编程因子的C末端上, 由于细胞穿膜肽是一类携带大分子物质穿过细胞膜进入细胞的小分子多肽, 这样的重组子表达的重组蛋白就可以直接穿过细胞膜进入到细胞进而进入细胞核, 从而启动细胞重编程过程, 目前, 重组蛋白诱导的小鼠和人iPS细胞都已成功建立[14～15]。重组蛋白诱导iPS细胞的方法因为不涉及任何改变细胞遗传信息的风险, 所以是目前所有研究方法中最为安全和可行的。

2.2.4 mRNA

利用mRNA替代DNA, 产生重新编码细胞所需的4种蛋白质。通过电穿孔或者阳离子载体将4个关键蛋白质的mRNA导入细胞, 从而诱导细胞改变原有程序而转变成iPS细胞, 这种方法使细胞重新编程的速度和效率大大提高, 只用以前的一半的时间大约只有17d, 而效率是以前标准方法的100倍以上[16]。

此外, 这种诱导转化而成的iPS细胞没有发生癌变情况, 而其功能却基本等同与胚胎干细胞。它比传统的诱导多能干细胞更像胚胎干细胞, 因为它们没有被改变基因。他们未来的目标是能够在未来使用干细胞充当新健康细胞的来源以取代被疾病破坏的细胞。

3 iPS细胞的应用研究

由于iPS细胞可由自体细胞诱导产生, 因而应用在疾病治疗方面不存在免疫排斥现象, 所以相比之下iPS细胞比ES细胞有更广的应用性。在再生医学、临床医学、组织工程和药物学等方面都有极大的应用价值, 必将成为生命医学领域的一个重要研究方向。将来自患者的体细胞表达外源重编程因子以诱导产生iPS细胞, 通过遗传修饰改正有缺陷的基因, 再分化得到功能正常的所需要的细胞, 以进行细胞移植治疗, 比如分化产生正常功能的运动神经元来治疗肌萎缩侧索硬化症[17]。

iPS的研究持续高涨, 并取得了许多令人瞩目的成绩, 但仍有许多问题需要搞清楚, 比如体细胞核重编程的具体机制, iPS细胞与胚胎干细胞究竟有无差异, 如何实现iPS细胞的定向诱导等等, 仍然需要进一步的探索。但毋庸置疑的是iPS技术必定会给干细胞研究领域注入新的活力。

摘要：诱导型多能干细胞 (iPSc) 具备胚胎干细胞的分化潜能, 同时又回避了伦理问题, 因此具有广泛且重要的临床应用价值。然而, 目前iPS技术仍然存在致癌性、效率低等一系列问题。针对这些亟待解决的问题, 本文综述了最近几年国内外在iPS细胞研究领域中的发展现状及研究方法, 并探讨该领域中急需解决的问题和发展前景, 以为诱导性多功能干细胞的研究提供一定的借鉴。

关键词：重编程,诱导多功能干细胞,研究进展

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