ELISA测定疫苗中庆大霉素含量的结果评价分析

在现有疫苗的生产过程中常加入庆大霉素等抗生素。抗生素类药物对感染性疾病有重大的治疗作用, 然而滥用抗生素会产生无法挽回的不良后果。中国和美国等国家都制定了生物制品中抗生素的最大残留限量指标, 以严格控制在生物制品生产中加入抗生素的量[1]。

常用的检测疫苗中抗生素含量的方法有微生物学方法、理化方法和免疫分析方法[2]。而间接竞争ELISA试剂盒测定法具有操作时间短、特异性好、速度快、操作误差小等特点[3], 以至于得到了广泛的应用。本文采用酶标试剂盒间接竞争ELISA法, 并将乙型脑炎减毒活疫苗进行10倍稀释来测定乙型脑炎减毒活疫苗中庆大霉素的含量。通过以庆大霉素标准品为对照物, 测定了疫苗制品中残留抗生素的含量, 以建立疫苗中抗生素含量检测的有效方法, 通过控制疫苗中抗生素的含量, 来提高疫苗使用的安全性。

1 材料与样品

1.1 试剂与仪器

庆大霉素ELISA快速检测试剂盒 (北京望尔生物技术有限公司) 。硫酸庆大霉素注射液 (批号09062027, 天津药业焦作有限公司) ;酶标仪 (Mode l550, 美国BIO-RAD) ;洗板机;微量加样器;电热恒温水浴锅;振荡器;庆大霉素标准品 (批号200814, 含量638U/mg, 中国药品生物制品检定所) 。疫苗稳定剂由广东省汕头市生物制品研究所疫苗室提供。

1.2 疫苗

乙脑减毒活疫苗和未含庆大霉素的乙脑减毒活疫苗购自广东省汕头市生物制品股份有限公司。

1.3 样品

1人份规格的乙型脑炎减毒活疫苗12批, 5人份规格的乙型脑炎减毒活疫苗12批, 均由北京天坛生物制品股份有限公司提供;生产原材料、原液、辅料及半成品由成都生物制品研究所生产管理部提供。

2 实验方法和结果

2.1 标准品溶液的制备

精密称取适量庆大霉素标准品, 加未含庆大霉素的乙脑减毒活疫苗10倍稀释液[4,5,6]配制成使庆大霉素含量分别为0.1、0.15、0.5、1.5、5、40ng/mL, 即得一系列标准品溶液。

2.2 标准曲线的绘制

采用间接竞争ELISA方法, 按试剂盒说明书进行操作。参考王静[7]等的对数直线方程法进行标准曲线的制备。以庆大霉素标准品溶液吸光度A450测定值的对数为纵坐标, 以庆大霉素标准品溶液浓度的对数为横坐标, 绘制标准曲线, 得标准曲线方程Y=-0.4354X-0.5431 (R2=0.9974) 。结果表明, 庆大霉素在0.1～8ng/mL范围内样本吸光值与庆大霉素含量呈良好的负相关关系 (表1和图1) 。

2.3 庆大霉素在乙型脑炎减毒活疫苗中的回收率

采用ELISA试剂盒的检测方法对庆大霉素标准品溶液进行加样回收率的检测。精密称取含已知庆大霉素含量的乙型脑炎减毒活疫苗10倍稀释液的同一份样品9份, 分成3组, 3组分别加入0.5、1.0、5ng/mL的标准庆大霉素溶液各1.0mL, 得低中高3种浓度的样品溶液。按ELISA试剂盒的检测方法测定样品溶液。计算庆大霉素在乙型脑炎减毒活疫苗中的平均回收率为96.27%, RSD为2.3%。说明此方法的回收率较好。可用于检测乙型脑炎减毒活疫苗中的庆大霉素 (表2) 。

2.4 庆大霉素在乙型脑炎减毒活疫苗中的精密度检测

取含标准庆大霉素含量为0.15、1.5、5ng/mL的低中高3种浓度的乙型脑炎减毒活疫苗的标准品溶液, 进行吸光度的测定, 每个样品重复测定3次, 计算日内精密度;连续测定3d, 计算日间精密度。通过测定和计算得到日内精密度的RSD为2.92% (n=3) , 表明此方法的日内精密性良好。日间精密度的RSD为2.46% (n=3) , 表明此方法的日间精密性良好, 结果见表3和表4。

2.5 乙型脑炎减毒活疫苗中庆大霉素含量的测定

将12批1人份规格的和5人份规格的乙型脑炎减毒活疫苗进行10倍稀释, 并按上述方法测定乙型脑炎减毒活疫苗中庆大霉素的含量。测得1人份规格的12批乙型脑炎减毒活疫苗的测定范围为10.11～14.6ng/mL, 平均值为12.32ng/mL;5人份规格的12批乙型脑炎减毒活疫苗的测定范围为3.08～6.14ng/mL, 4.87ng/mL。结果见表5, RSD均<10%, 说明同一剂量不同批号间的乙型脑炎减毒活疫苗所含有的庆大霉素量比较稳定, 各个批次间差异较小, 用于疫苗中抗生素含量的测定, 其适用性较好 (表5) 。

3 讨论

抗生素残留量的检测常用3种方法[8]:微生物学方法、免疫分析方法和理化方法。传统的微生物检测法特异性差, 易被非抗生素抑菌剂所影响;而免疫分析方法具有操作时间短、特异性好、速度快、操作误差小等特点, 以至于得到了广泛的应用。在乙型脑炎减毒活疫苗生产过程中加入了多种物质, 成分复杂, 不仅有病毒液, 还加入了稳定剂, 这些成份有可能对抗生素含量的测定存在干扰。文献报道[9,10]庆大霉素采用试剂盒的方法其检测限度可达到0.1ng/mL, 但在使用试剂盒检测时, 疫苗稳定剂明显干扰庆大霉素的测定。然而通过使疫苗稀释的办法可减小其测定的干扰。因此本文通过采用ELISA试剂盒并稀释疫苗的方法对抗生素进行检测, 使疫苗中各成分得到稀释以减少其含量测定的干扰[10,11]。通过此方法所得的回收率较高 (96.27%, RSD为2.3%) , 线性良好 (0.1～8ng/mL, R2=0.9974) , 试验内和试验间精密度的RSD也均<10%, 精密性好。实验中检测了1人份规格和5人份规格的乙型脑炎减毒活疫苗各12批, 测得庆大霉素含量的平均值分别为1 2.3 2 n g/m L (RSD=2.3 5%) 和4.8 7n g/m L (RSD=1.82%) , 表明同一剂量不同批号间乙型脑炎减毒活疫苗所含的庆大霉素量变化不大。

摘要：目的 用间接竞争ELISA试剂盒检测庆大霉素在乙脑减毒活疫苗中的含量并对观察检测的结果进行评价分析。方法 使用10倍稀释乙脑减毒活疫苗液配制庆大霉素标准液, 以间接竞争ELISA法检测疫苗在一定范围内的庆大霉素含量, 并对该方法的线性、高中低浓度的加样回收率、精密性等进行验证, 并对抽选样品进行检测。结果 庆大霉素在高、中、低3种浓度乙脑减毒活疫苗10倍稀释溶液中的回收率分别为90.00%、97.00%和101.8%, 平均回收率为96.27% (RSD=2.3%) , 有效检测范围为0.1～8ng/mL (R2=0.9974) 。检测的样品含量稳定 (1人份的RSD=2.35%, 5人份的RSD=1.82%) 。结论 表明ELISA方法可用于疫苗中庆大霉素含量的检测, 适用性较好。

关键词：ELISA,疫苗,含量,庆大霉素

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