儿童常见问题解析
第一篇：儿童常见问题解析
关注农村留守儿童解析
一、何谓农村留守儿童
随着我国经济的发展和城镇化进程的加快，越来越多的青壮年农村人口进入城市，其中一部分孩子随父母涌入城市。但是更多的孩子没有条件随父母流动到城市，只好继续留在在农村。他们由自己的祖父母或其他亲戚照料，这类未成年的特殊群体称为留守儿童。简言之农村留守儿童是指父母双方或一方进城或到经济发达地区务工而被留在老家的那些孩子。
当然这些外出打工的父母对自己的孩子的学习和生活一般都做了一定的安排，据此可将农村留守儿童分为以下几种类型：
1.父母双方中的一方外出打工而由父亲或母亲一人单独抚养的孩子，从某种角度讲可以成为“单亲家庭”孩子。孩子在这样的家庭中较普通家庭的孩子(父母均在身边的孩子)来说，欠缺父爱或母爱。
2.父母双方均外出打工，孩子由祖父母或外祖父母抚养的孩子，从而形成了隔代抚养的现象，这种情况占农村留守儿童的绝大多数。孩子在这种家庭中成长缺乏父爱和母爱，得到的多是祖父母的溺爱。
3.父母双方外出打工，被托付给亲戚照管的孩子，这种也较为常见。
4.还有小部分外出打工的父母安排孩子在校寄宿或采用其他民间托养的形式。如有的父母为孩子聘请了代理家长，这些代理家长同农村留守儿童的家长都签订了协议书。家长每年为此付出一定的代理费用，代理家长必须照顾好这些孩子的生活起居并教育管理好孩子。
由于长期缺乏亲情的关爱、父母的有效教育和管理，他们的健康成长已经成为当前社会一个不容忽视的问题。
二、留守儿童存在哪些问题
记得曾经看过一个留守儿童在他的作文里这样写道：“一个人就是一个家，一个人想，一个人笑，一个人哭。我很小的时候父母就出去打工了。不知道什么是父爱什么是母爱，就连他们的样子都记不清了。我考试从来都不及格，自信心有多差就不用说了，上学期我考了最后一名，这学期我不想考最后一名了。”这是许多留守儿童的心声，读后不免让人揪心。在亲情长期缺失的状态里，这些孩子已经产生了一系列心理、道德、学习等方面的问题，归纳起来主要有以下几个方面：
第一，安全问题。留守儿童虽然有一定的监护人，但父母所委托的监护人如长辈家属、亲戚以及代理家长等，由于年龄、经济、生活等等各方面的原因，无法对孩子进行有效的监管。而且他们往往认为只要让孩子吃饱穿暖就算尽到了监护责任了，至于其他的事情则是孩子学校的事了。因此在课余和节假日等老师无法监管的情况下，留守孩子则成了绝对自由的人，想干什么就干什么。我们知道孩子往往缺乏自我保护意识和能力。父母不在身边，没有他们直接的关爱和教育，孩子往往易成为某些不法分子的攻击对象，。
第二，心理人格问题。
据大部分有关留守儿童的调查显示：心理健康和人格发展问题是留守儿童最容易出现的问题，也是最突出的问题。由于留守孩子缺乏与父母沟通交流的机会，存在严重的“亲情饥渴”，而其他监护人替代不了父母应该要履行的完整的监护职责。所以留守孩子在遇到成功、失败、进步、忧郁、悲愤、孤寂等不同的情形时，没有自己信赖的长辈可以倾诉和指导，往往只能自己处理。尤其当他们遭遇挫折时，他们不愿意与监护人交流，在心理、性格上很容易走上极端，多出现以下方面的问题：(1)自卑封闭、自暴自弃、缺乏自信，上进心不强。不愿意与人交流、性格内向，不开朗。老师找其谈话容易掉眼泪。(2)自尊心过强内心较敏感对老师亲友等的管教和批评容易产生较强的逆反心理。总感觉有人在欺负他，斤斤计较，不合群。(3)对父母产生怨恨情绪认为父母为了赚钱而抛弃了自己，对父母的外出不理解，父母回家了甚至故意疏远他们。心理方面。良好的家庭氛围、和谐的亲子互动对健康心理的形成有着重要的促进作用。现有的研究从不同的方面反映了留守儿童的心理问题。留守儿童在心理健康方面的问题主要有以下表现：一是孤僻内向。由于缺乏父母关爱，交流渠道不畅，留守儿童难以向外界表达自己真实的思想，容易形成自闭的心理;此外，留守儿童在与同龄人交往的过程中，由于显性与隐性的现实差距，自己的想法不能得到及时的疏导，内心容易产生严重的自卑感和受挫情绪。二是冷漠乏信。长期得不到亲人关爱的留守儿童渐渐淡漠了对亲情的渴望。亲情呵护的缺位，孩子在一个缺乏温情的环境中长大，使得孩子们不懂得去享受爱，去关爱别人;心理支持的缺失，孩子缺乏应有的鼓励和肯定，导致孩子自信心不强，以至对成功的期望值偏低。三是心胸偏狭。留守儿童过早过多地体会了生活的艰辛，认识到父母外出打工是生计所迫，容易产生社会不公的意识。因此，他们对社会的认识会多些灰色成分，便产生了仇视他人，仇视社会的心理倾向。这使得他们认识问题和解决问题时容易产生偏狭的认识和过激行为。
第三，道德品行问题。
留守儿童一般为学龄前儿童、小学生、初中生，正处于心理成长的关键时刻。如果是有祖父母来隔代抚养教育，往往意味着由文盲来抚养孩子;而托付亲戚照管的，亲戚普遍认为不便过多管教或经常盘问，毕竟不是自己的孩子;而农村教师由于受到教育条件的限制，对每个学生的关注也十分有限。所以留守孩子由于长期处于这种状况中，在行为习惯上容易发生消极变化，且难以及时得到纠正，有的甚至出现了较为严重的违法乱纪的现象，严重影响了他们的健康成长。品德方面。留守儿童由于父母长期远离，无法感受父母在情感上的关爱和呵护，在价值观念、道德规范以及行为示范方面缺乏应有的指导，加上隔代教育本身存在的许多弊端，如纵容溺爱，重物质满足轻道德教育，又因农村环境的特殊性，留守儿童在道德评价、行为习惯上极易发生消极变化。主要表现在放任自流，不服管教，违反校纪，小偷小摸，看不良录像，沉湎于网络游戏之中，或者同学之间拉帮结派，与社会上的问题青年纠合在一起抽烟、酗酒、赌博、抢劫等。有些孩子由于失去父母的监管，甚至走上罪恶的深渊。
第四，学习问题。
那些有祖父母隔代抚养的孩子，由于爷爷奶奶的文化水平较低，无法在学习上得到帮助和指导。而双亲有一方在家的孩子同样很难得到父母在学习上的辅导。因为留在家的父亲或母亲一个人承担了全部的家务和田间工作，没有时间去关注孩子的学习。绝大多数农民工选择背井离乡外出打工是希望通过自己的努力，让家人的生活越来越好，让孩子能有条件上好学，接受好的教育，日后有出息，不再走自己的路。但往往事与愿违，有调查表明，留守儿童大多数成绩中等或中等偏下。当然一部分留守孩子学习认真，但外出父母的期望值过高，孩子学习压力大，一旦遇到挫折就容易一蹶不振;一部分儿童由于自控力差，无人督促学习，再加上受外界的影响，认为学习与否都一样，对学习毫无兴趣。留守儿童正处于学习的黄金时期，理应在良好的家庭和社会环境中接受完整的教育，在学业上不断取得进步，但由于缺乏父母有效的监管，留守学生难以形成良好的学习习惯，经常发生不完成家庭作业、逃学、辍学等现象。因此，父母的关爱、监管以及必要条件的提供是孩子在学习上取得进步的重要前提
三、如何解决好农村留守儿童问题
农村留守儿童出现的问题，不仅会危及这些孩子的健康成长，而且会给农村的教育以及社会发展产生较大的负面影响，能否解决好这一问题意义重大。这个问题的解决将有助于农村普及九年制义务教育的真正落实和质量的提高。而这个问题的解决有赖于家庭、学校、社会、政府多方面的共同努力和合作。
1.从家庭教育角度讲。首先，父母在委托监护人之前，应该慎重考虑被委托人是否具备监护能力，如身体、经济、思想品德状况。如果被委托者年龄很大，身体欠佳，本身的行为能力有限，那么这种委托不但没有意义，甚至有害。其次，父母应该利用多种方式和途径对留在老家的孩子的学习、生活各个方面加以关心、教育和指导，例如多打电话给孩子及委托人、老师等，并向其询问孩子的基本情况。第三，如果条件允许，尽可能的将孩子带到自己务工的地方上学，让孩子在自己的身边成长。现在国家对于外出的农民工子女上学问题也一直在采取办法加以解决。第四，父母应善于将自己在外打工的经历以适当的方式对孩子进行教育。目前，大家关注较多的是给留守儿童造成的困难。但实际上留守背后蕴藏着一笔巨大的教育财富。外出打工的父母若能将自己背井离乡的生活的痛苦与磨难，各种吃苦耐劳、拼搏向上的先进事迹来教育自己的孩子，从这个角度讲，父母与子女间的联系不是减弱而是加强了。因此，以父母外出打工的种种正面经历为教育媒介，加强留守儿童与父母的沟通与交流，应该成为留守儿童教育的主要措施。 最后，提高父母对孩子教育问题的认识。父母是孩子的第一任老师，家长对于孩子的影响是最大的。若要培养孩子健全的人格、健康的体魄、良好的品德和优秀的才干，父母是要有奉献精神的。因此，父母在这方面应有开阔的眼界和长远的打算，在物质条件基本满足的情况下，应该多为下一代考虑，多关心他们的成长与发展。笔者认为，处于义务教育阶段的孩子至少应有一位家长留守，这对于孩子的人格的培养和学业成绩都是有益的。
2.从学校教育的角度讲。学校教育应该成为影响留守儿童成长的主渠道。努力使学校教育与社会教育、家庭教育形成合力。这就要求学校教育不仅要完成校内对留守儿童的教育，同时应该有意识地向留守儿童的校外生活延伸，以弥补他们在校外的生活真空，促进他们的健康发展。对此，学校应充分发挥教育优势，特别注意与家长的联系沟通，提高他们对教育的认识。对于父母常年外出打工学生，老师要加大家访力度，或通过电话、信件等形式，向家长汇报孩子的学习、生活和思想情况，有的放矢地进行教育疏导。针对留守儿童的品德行为偏差和心理障碍问题，定期开展心理咨询、心理矫正工作。同时，学校可以开展围绕反映留守儿童家庭的班会，引导学生形成关于父母外出打工现象的正确认识;也可以邀请有外出打工经历的父母参与班会，通过他们打工经历的讲述，和打工者与学生间的直接交流，使留守儿童理解父母，尊重父母，形成正确的生活观。
3.从社会的角度看。留守儿童较之普通儿童只是由于生活环境中约束因素、沟通与指导因素的缺失，而具有一种被周围不良环境影响的更高的可能性。为此，应调动社会各方面的力量，为农村留守儿童的健康成长创造良好的外部环境。尽管学校生活是留守儿童最主要的生活方式之一，但是整个社会生活中的任何一类因素都会或主或次、或隐或显、或直接或间接地影响留守儿童的成长与发展。所以要加强农村乡镇文化建设，大力整治校园周边环境：打击违法经营的网吧、电子游戏室等，根治各种精神污染对孩子的毒化，让农村中小学生在良好的环境中接受教育和熏陶。
4.从政府的角度看。彻底解决留守儿童的问题，需要各个部门和各级政府的协作才能完成。从横向看，各部委应协调以尽本部门应尽的责任，如政府的公安、新闻等职能部门，应切实履行自己的职能，与学校共同承担起留守儿童的教育和保护责任。从纵向来看，中央、省市和地方政府，应协调政策和统整资源来有效解决这个问题，例如，政府有关部门应该对进城务工的农村家长进行引导和教育，强化农民工家长的家庭教育观念，让农民工家长学会与孩子交流沟通及教育孩子的正确方式，发挥家长对孩子独特的教育功能。政府应该主动承担相应的责任，提前做好准备。有条件的农村，地方政府可为开办寄宿制学校创造条件，尽量为留守儿童提供住宿方便的同时，让他们在老师、同学等群体中得到温暖。
5.从国家的体制与制度角度看。体制改革与制度创新是解决留守儿童教育问题的重要保证，留守儿童教育问题的存在，某种程度上是由于“不为”，而非不能。2003年，国务院办公厅转发了教育部等六部委《关于进一步做好进城务工就业农民子女义务教育工作的意见》，文件中明确规定“农民工子女就学应该以流入地政府管理为主”，“以全日制公办学校为主”。为了全面贯彻国务院文件精神，很多地方也出台相应的政策规定，并相继取消了对流动人口子女入学的借读费。但还有很多城市，在学校资源闲置的情况下，依然对农民工子女的入校设置了难以逾越的门槛，导致了大量儿童留守，无法接受良好的教育。因此，国家教育行政部门应该从实际出发，在制度机制上不断创新，创造条件，充分利用城市中小学的教育资源，让更多的学校愿意接收农村儿童。如可以考虑设立协商机制和代偿机制等，只有完善了制度，才能更好地关爱留守儿童。
总之，农村留守儿童的教育不仅对家庭、学校而且对我们整个社会教育体系都提出了严峻的挑战，在目前各项教育远未善学校教育还没有条件深入到留守儿童学校生活之外的情况下，留守儿童的教育任重而道远。 由于“留守儿童”这个特殊的群体正处于义务教育阶段年龄，他们的数量、他们的生活和教育状况以及由此带来的对社会的影响，我们理应给予积极地关注。
第二篇：销售常见问题解析
1、网上了解价格
这类客户通常会连续转过几家店后才会决定是否购买，例如：在网上了解的是N518 来店后直接会问N518多少钱，销售员在这时千万不要直接报价，因为我们在价格方面没有优势，当客户问这个问题的时候是一个非常好的转型的一个机会，通常我会说您好，电纸书N518系列有三款型号，不知道您说的是哪款，此时要看是什么样的客户，如果是那种比较强势的就不要吞吞吐吐的，要自信一些很有底气的报价：N518我们全国的统一价格是XXXX当客户转身要走时一定不要放弃，紧跟一句您就看中518了吗?我们最新的产品您了解一下吧，我给您介绍一下好吗?通常客户都会停下脚步 等待你介绍，这时的机会很大，接下来你可以问客户问题，先要了解客户对产品到底了解多少，根据他所了解的一些产品相关的东西你在给出相应的问题和解决方案，切忌：想尽一切办法给客户惊喜，最后让他觉得你给介绍的产品才是他最需要的
2、长期关注价格 经常在卖场里询价
这类客户通常会给销售员一个假象，路过我们店面的时候会顺嘴问一句你家XX电纸书多少钱，你说什么都不理你就让你报下价格，然后转身就走。
如果遇到类似这样的客户大家不要慌，越是这样的客户说明他越是谨慎，越是谨慎就越经不住我们吓，这时最好的武器就是我们的形象， 案例：我遇到过这样的一个客户，产品是N518我报的价格是2980 当时他就很生气说了一句你们怎么这么贵，当时我就觉得有希望，我说不是我们价格贵，是全国都是这个价格 我又问他您问到多少钱啊 他很不情愿的告诉我2600 我就笑了一下您被骗了 应该是2300当我说完这句话的时候客户就是满脸的疑问紧接着我就很热情的把请进店里 跟他说产品售后，给他赠值服务，跟他讲为什么价格乱为什么什么价格都有在问他相关的需求为他提出其他的方案，有的时候即使你知道客户就是要高端你也要适当的推下低端很真诚的和他说：其实您用510就可以了完全不用那么高端的，让客户觉得你是在为他着想，是客户更加信任你 最后价格绝对不是问题。
备注(请专卖店的销售人员利用好自己的形象，我们的专业术语，一定把讲客户和谈客户区分开，朋友式的聊天和买卖式的交易谈话给人的感觉是完全不一样的，一切为客户着想 最后肯定是谈客户，而不是讲客户)
3. 预算有限
我比较喜欢转型，我相信每个人都有自己的销售方法 我最喜欢的还是转型，因为在转型的过程当中你又机会和客户走的更近，让客户更加信任你，主要表现就是你在不停的为他解决问题，最后你选出的产品肯定是可以满足他需求的产品。转型的前提 对产品要非常了解，任意拿出几款产品都要说出各自的优势 无论高端低端都有个自得特点 用心就能想的出来 简单列举几个低端比高端价格除外。 1 N510D20510待机时间超长 一定比d20长 稳定性好体积小 比D20更方便携带
2 n517n518单手持的时候517明显比518要舒服，518指示灯亮影响看书，体积比517重，笔没有517的舒服
3d21f21我想每个人对这两款产品都很尴尬 有 D21的时候针对个人用户F21就不知道该怎么推了 不过个人发
现F21翻页速度要比D21快很多
请大家根据个人需求去推相应的产品，不要一味的推高端，一切为客户着想才是一个成功的销售员该做的。
产品技巧的演示
位置: 这里的位置是指你和客户所站的位置，1 、你要站在一个不容易让客户很轻松就出店的位置可以理解为客户前面让他不容易摆脱你
2、尽量的和客户站的近一些 特别是中老年人 因为卖场一般都比较杂乱 有的时候你在介绍产品的时候容易听不清对你销售产品有影响
3、尽量让客户正面对着一个死角这样的话在你给他演示的过程中避免它看见代理商的店 让他的注意力集中在你的店里防止出去询价
演示内容:产品演示前尽量装一些市面上比较畅销的书籍，或比较不错的有声读物，来吸引客户，初步让客户产生兴趣，尽量找一些比较不错的PDF文件或者反复试验不出问题的 WORD文档，在演示带手写的电子书的时候一定要让客户体会到汉王手写识别的功能，在演示OCR软件的时候尽量用公司提供的演示样张。根据需求演示功能 给自己留有余地：销售过程中要问清客户需求了解需求后在演示相应的功能，在没有确定成交的情况和已经满足客户的初步需求的时候 剩下的产品特点先不要说，因为这一点可能成为我们和客户谈判最后的底牌，同时也是为转型做铺垫
销售过程中要问的问题
其实在销售过程中有很多问题，并不是固定的 我总结的这点也只不过是平时比较常问的，主要的目的还是要引导客户，帮助客户发现自己需求， 但在问问题之前请销售员一定不要刻意的去问，是在两个人聊天聊的挺投机的时候去问 ，比如第一句就在客户进店点名电子书的时候去问，主要起两个作用 1 、看客户是否对我们的产品有所了解，如果说听说过 或者直接说了解过那这个人很可能就知道产品的价格在报价的时候就要多加注意
2、如果说没了解过 那我们就可以热情主动的和客户说那您坐 我给您详细介绍下，紧接着拿出演示机给客户讲解。 第二问题就是要近一步的锁定客户的目标。看客户到底需求什么样的产品， 第三个问题主要还是在同客户沟通的时候去提出来这个问题的目的是吧客户引开，当客户说出喜欢看什么书时可以把我们准备好的资源给客户看 ，近一步交流 了解客户。当客户自己不知道该选择什么，或者你和客户已经谈的很好的并且很信任你你可以这样去发问 您觉得这款怎么样? 可能客户已经有理想的选择 可你提出这个问题可能会给他一个新的惊喜。第五个问题当客户被你说东心了在犹豫的时候千万不要和停下来 。这个时候问这句话是最合适的 因为如果你帮他解决完他担心的问题他基本没有退路了当你给客户介绍完产品，并且很全面客户仍以言不发 起身要走 这时一定要上前问一句，肯定是你之前某个细节出了问题不要放弃近一步了解。在销售过程中没有固定话术，大家记住一点引导客户 不停的抛出问题和难题，然后在不停的解决你所给客户抛出去的难题。 @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@2
首先，卖产品就是在卖自己，顾客之所以会选择购买你的产品就是因为相信你，相信从你口中介绍出来的产品，你在推销你的产品的同时也是在推销你自己，所以想做好销售就要先学会做人。
销售是一门学问，不是简单的介绍产品，报个价，这样的事情任何人都能做得来，就像“轻松销售法”里面所说的以明确、清楚、只锁定一个目标为一个方向。每一句就是要达到一个目的为一个单位。比如如果顾客正在询问产品可以这样主动反问顾客问题：“先生/小姐，请问您是个人用还是单位用”这样问的目的是要了解顾客是个人用户还是单位采购。
做销售最重要的一点就是要“强势”，在有些人看来强势是厉害一点，态度
蛮横一点，其实不然。强势是让你在跟顾客交流时能占有主动权，主动去引导顾客，使顾客跟着你的思路走下去，不要出现顾客带着你走的局面，这样销售产品会显的比较被动，换句话说顾客会欺负你，比如讨价还价，索要赠品等。如果你不能满足他的要求他就会拿不买来要挟你。
总的来说今天再看轻松销售法要比第一次看理解的更透彻一点，因为这毕竟是自己做零售的这一年来亲身经历的事情，想说的还有很多现在就分享到这里。 @@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@2222
将客户依照其个性分解为17种类型，根据这些客户类型的谈话特点，我们相应采取一些沟通谈话的对策
1、健谈型
客户可能只顾自己的感受畅谈，不要让夸夸其谈的顾客将你引入和销售会谈毫不相关的其他话题中，要抓住一切机会礼貌地将谈话引入正题。(经常会有被说晕的感觉,听对方滔滔不决的讲他们公司和公司的产品)
2、少言寡语型
这种客户说得太少，甚至你问一句他就答一个字，不然就是用“哼”、“啊”作答。然而，你不要失去耐心，尽量不要用封闭式的提问，提出一些不能仅仅用“是”或“否”回答的问题，选择开放式的提问打开他的话匣子。话语要显示出你获得信息的热情，来调动客户的积极性。要比平日更具耐性，直至客户开尊口，并示意客户说下去。(说了半天对方没音，还要来一个喂?一定不要出现这个景象,一定要多问客户)关键字“什么”、“哪里”、“告诉”、“怎样”、“为什么”、“谈谈”、“如何”
3、因循守旧型
这种客户会聆听，但会在购买决策上磨蹭，如果不及时采取促成交易的行动或条件，时间消耗下去也将会失掉这单生意。要向客户指出信息带来的帮助，如果有非常合适的项目也可以提供给他，或提出来更好的方案。如果这次你的提案和以往有些不同也可以强调新方案的优势，说明与以往的不可比性。
4、反对型
往往客户上来先表示反对，来挫你的锐气。事实上是要争取谈判的主动地位。有可能反对是无理的，但你尽量不要与其争论和回击、保持冷静，听他把话说完，同时面带微笑表示谈判还可以进行下去。一方面你抓住客户提出的需要(主要是执行效果的)表示可以调整方案
如果你能够现场就把方案调整过来了，马上再来询问“如果这样如此--------可不可以?”;另一方面把客户的意见加到方案中，来确认“您看是不是这样?”。*若客户再反对，你可能要重新思考方案的价值了，*给自己留后路先撤回来*，请客户再给机会进行下一个方案*。
5、胆怯型
这类客户往往是没有经验或没有决策权，不愿意负责。如果是他没有经验，要提供引导、保证和支持，帮助客户克服成交的担心心理，鼓励客户，证明他决策的正确，使其放松压力，表示你可以成为他信任的朋友。若是他没有决策权，一方面可以陈述方案的要点与效果的描述令他确信这是个好生意;再有就是请他引见
能够决策的人物出场。
6、自我为中心型
这种客户具有优越感、愿意用以上对下的口吻讲话。保持上下的距离会令他有良好的感觉。仔细地聆听并且恭维他，在合适的时候，向他征询意见，把他的主意变成你的生意。 (如果您的业务可以辅射到河北，天津就建议您用个北方区更划算，您看呢?)
7、果断型
这类客户很自信，知道将要得到什么。如果方案得到认同不要给客户过多的销售解释，尽快将注意力提到合同要求上。对客户关心的内容只给必要的细节，要严格忠于事实，因为他可能是通过细节来验证他的判断。
8、精明型
这类客户善于搬出不同方案进行比较，或用一方的信息销售人员的方案对付另一方信息销售人员，要应用巧妙的恭维来表达对他的判为讨价能力的赞赏，同时表示在象他这样如此精明的客户面前，你就遇到了识货的人/懂行的人/专家。这类客户是砍价的专家，甚至胡砍一通，你就更要采用“示弱”的姿态，点明对方的精明已经使你无利可图，要对方手下留情。(您可真是高手，我们从来没有过您这么多的增值服务，希望您今年用的好，能与您长期合作我非常荣幸)
9、质疑型
这类客户会找到方案中的问题点提出怀疑，不要躲避问题，对他的反对做出反应，但不要和他争论，确实是你的问题就坦然承认，也别做过多解释，否则你越描越黑，给他感觉问题越来越大。若不是你的问题，只是对方虚张声势或小题大做，要敢于说话，应用逻辑和已证明的事实，有可靠的数据支持最好。
10、牢骚型
这是个事事不顺心的客户，牢骚是他发泄和减压的方式。你要特别快乐，不要被他的心情所影响，力图找到困扰他的麻烦是什么，搞清是与你方案有关的原因还是除此之外的原因。是与你有关的原因，要听清楚，表示同情和关切。是你能解决的不妨表示可以帮忙试试，千万别都揽下来!有些你做不到。若不是你的原因，客户他发完了牢骚可能就好了。别让客户陷在牢骚里，乐观开导，转移话题，为了继续谈你的事。 (立邦)
11、条理型
这类客户做事缓慢，似乎对你提出的每句话都在权衡，你急他不急。你表示很急切，可能他会采取更保守的态度，或用你急切的心态压制你。调整你的步伐，和他保持一致，放慢速度，你可能还可以获取对方更多的需求信息，在给对方的方案还可以尽量向细节上扩展，使他有充分的时间接受如做些宣传方面的信息。最好在见面前就给他方案，留时间让他消化，但也要注意方案的周全性。
12、依赖型
这类客户在做决定时需要有人帮助、参谋，来证明他决定的正确。你最好把参谋的角色担当起来。为了解客户的需要，在你可以在首次接触时就问他一些问题，然后在后面跟进时说明你的产品方案就是为他量身订做的，能最好地满足他的需要。在谈话时将上一次的结果作为这次的开始，“您上次要我做一个有关某某的计划，我给您做好了”“我把和您沟通的内容
做了一个方案,我给您发过去您看一下?”。在细节的处理上，可以解释为就是围绕客户的要求制定的
13、挑剔型
这类客户看好信息可能也不会说OK，因为至少他要与你讨价还价，还会提出一些不满意，实际上，他需要你的东西才会花精力与你谈判，你必须强调信息的好处,后期的增值服务,证明我们的信息值这个价钱，而且不要把你能守住的底价过早地报出来，留有还价的余地。再有，做让步的时候要让对方感到，你的每次让步都是不容易的。而且可以让对方付出一些代价，例如你答应客户提出的优惠的价格，但要让对方介绍几个客户等。
14、冲动型
这类客户很容易下结论，谈判的节奏也比较快。见面要直接步入正题，不要绕圈子，可以提出建议，通过这个建议客户就能直接提出结果。就是说结论要从客户的嘴里说出来。你要注意的是把合同带上，能签就签，不往后拖。
15、分析型
这类客户喜欢数据、事实和详尽的解说，这种客户富有条理，如果对客户提案需要做些数据支持的准备，在提案过程中注意你的条理性，给客户的信息越多越好。结论最好是清楚的，不要模棱两可。(一般在和市场部策划部负责人谈判时会遇到这样的问题,特别是一些大企业)
16、感情型
这类客户对个人感情看得极重，你应该和这类客户逐渐熟识，每次通话都带给他一个好消息或提到一个好消息，让他能高兴起来。全身心地投入谈话并且保持你对他的专注。和他建立日常联系，建立私人友谊对工作深有益处。
17、固执型
这类客户总是装出很重要的样子，摆老大的派头。他如果对方案明显地表示出错误和不专业也不要指出来，向客户表明你是极尊重他的，抬高客户，同时也抬高你自己，有可能的话向他致以真挚的夸奖。注意他流露出来的意向，抓住他的意思，把你的主意变成是他的主意通过的可能性就会大大提高。
一流的公司卖标准
二流的公司卖品牌
三流的公司卖服务
四流的公司卖产品差导化
五流的公司在同质化的产品下打价格战
只要用心,一切皆有可能
销售是一份灵活的工作,只要用心去分析和维护每一位新老客户,那么一定可以做出卓越的成绩
第三篇：发票违法常见问题解析
财税聚焦】发票违法常见问题解析
加“点数”开具发票、超额开具发票、凭小票过几天再来开发票……消费者在索取发票时有时会遇到类似情况，有的商家甚至拒绝提供发票。广州市国税局票证中心工作人员表示：“这些行为都是违反发票管理规定的，消费者可向税务机关举报。”
近年来，为规范发票使用管理，保护消费者的合法权益，广州国税部门加大发票宣传力度，通过网站、微博、微信、手机短信等形式普及发票知识，并通过免除发票工本费、设置发票代开点、发票的领用及验旧当场办结等服务措施，提高发票领用效率。同时，国税部门进一步解析下列发票不合规行为和违法常见问题，打击发票违法活动，为消费者提供支持和帮助。
拒绝开具发票
某服装店因担心发票保管缺乏安全性，未向税务机关领用发票，消费者购物后索取发票，服装店以未领用发票为由拒绝开具，消费者向税务机关作了举报。根据《中华人民共和国发票管理办法》第十九条规定：“销售商品、提供服务以及从事其他经营活动的单位和个人，对外发生经营业务收取款项，收款方应当向付款方开具发票。”该服装店拒绝开具发票的行为违反发票管理规定，主管税务机关对其进行了处罚。
国税部门提醒，未领用发票不能成为拒绝开具发票的理由。目前，
国税部门采取了多种措施为纳税人发票领用提供了非常便利的条件：一是在数量上，根据纳税人的经营范围和规模确认纳税人所需使用的发票种类和数量，充分满足纳税人的发票使用需要;二是在费用上，全面免收了发票工本费;三是在程序上，发票领用和验旧业务现在都可当场办结，为纳税人提供优质的服务;四是在途径上，没有领用发票的纳税人如果需要使用发票可以到税务机关申请代开发票，代开发票也是即时完成的;国税部门在部分专业市场还设置了代开发票点，满足纳税人的开票需求;除了到办税大厅直接办理以外，还提供了网上受理、网上验旧等多种办理渠道，进一步为纳税人减少办理环节和缩短办理时间，真正实现按实际经营需要领用发票无障碍。
附加条件开具发票
消费者在某电脑经营部购买电脑时，询问是否可以开具发票，该经营部表示开具发票需另加“点数”，并且可按照“点数”开具超过实际交易价格的发票。根据《增值税暂行条例实施细则》的有关规定，小规模纳税人的销售价格为含税价格，该电脑经营部应当无条件按销售金额为消费者开具发票，不得额外加收任何费用。另外，根据《中华人民共和国发票管理办法》第二十二条规定：“任何单位和个人不得为他人、为自己开具与实际经营业务情况不符的发票”。国税部门表示，加“点数”开具发票或超额开具发票的行为对国家税收利益和正常的经济秩序都有明显的破坏作用，是明确禁止的，一旦发现，将面临严厉处罚。
国税部门呼吁，每个消费者都是税法的监督员，为了保护自己的合法权益、共同维护市场秩序，建议消费者进行实际交易后无论是否需要报销，都应该主动向商家索取发票，发现商家不按规定开具发票的，及时向税务机关举报，也请全社会都遵守税法，为营造诚实守信、公平公正的税收环境而共同努力。
未按规定时限开具发票
延期开具发票
某家居用品连锁店是某大型家居用品销售公司下辖17家非独立核算门店之一，总机构为一般纳税人。消费者向该门店索要发票时，店方表示需要回总公司开具，大概需要10天左右。根据《中华人民共和国发票管理办法实施细则》第二十六条规定：“填开发票的单位和个人必须在发生经营业务确认营业收入时开具发票。”如果纳税人已收取销售款项，应即时开具发票。
经了解，该销售公司目前使用增值税专用发票和增值税普通发票，购置了两套税控开票设备，放置在总公司。门店有消费者需要开具发票，则登记消费者名称、联系地址、联系方式，待公司开票人员统一开具好发票后，再通知消费者凭销售小票领取，或由门店将发票邮寄给消费者。国税部门表示，该公司虽为统一核算的连锁经营企业，但不能以此为由延期开具发票，既违反了发票使用规定，又增加了消费者的成本和负担。
错期开具发票
某个体户到国税机关办税服务厅办理发票验旧事项，税务机关发现其共有17份百元版发票的开票日期早于领票日期。经了解，该纳税人由于未及时领用发票，对已发生的经营收入按实际发生的日期补开购票，存在未按照规定的时限开具发票的违法行为。国税部门提醒，开具发票必须在领用之日起开具，如需补开应在备注栏说明。
第四篇：质粒提取常见问题解析
涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死?
参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。
原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法：
1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。
2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。
3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下!
【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：
1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。
2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】
未提出质粒或质粒得率较低，如何解决? 参考见解：
1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。
5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少;若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。
7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。
9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
11、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
12、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。
细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状? 参考见解：
1、很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用PBS将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。
2、质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。
3、判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。如果发现呈泥水状，即看不到絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。
4、菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。达到OD600 1.5就可以了，(尤其是对于试剂盒提取要注意)另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提(安全考虑，慎重)，只要溶液I/ II /III比例恰当，转管过程仔细吸取不会有太多杂志。
为什么加了溶液Ⅱ后，菌体没有逐渐由混浊变澄清?提出来的条带几乎没有，但是RNA很亮(没加RNA酶)?
溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清，参考见解：
1、可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的CO2失效。RNA在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较DNA明显的条带。
2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这也会导致质粒产率低下.
3、可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高.如果是使用自己配的试剂，建议做中提或大提;或者买试剂盒提.用自己配的试剂，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干净就要用比较好的RNA酶。
4、如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化(数量变多)，很难使用碱裂解法，可以尝试用其他比较剧烈的方法(比如高温或者低温研磨等),然后使用一般的发放。
5、可能质粒随乙醇一起倒掉了。
加入溶液II后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变? 裂解不完全,参考见解：
1、问题可能是发生在溶液II上。首先看看10%SDS是否是澄清的?NaOH是否是有效的?如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀?
2、可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液I/II/III的体积。
3、可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。抽提DNA去除蛋白质时，为什么要是酚/氯仿混合使用?怎样使用酚与氯仿较好? 参考见解：酚与氯仿都是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%～15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合(1:1)使用。
呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?
参考见解：保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以使用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1%。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或-20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。
为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇?
参考见解：在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，可以降低抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1(不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成)，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 加入酚/仿抽提，离心后在水相和有机相间没有出现变性蛋白相层，在随后的乙醇沉淀步骤中却出现大量的半透明沉淀，溶解后发现蛋白浓度很高?
乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀是白色的(PEG纯化的沉淀是透明的肉眼不易发现)，如沉淀是半透明的凝胶状，则应是蛋白含量高。参考见解：首先看看平衡酚是否已被氧化?pH是否是8.0?其次检测溶液III反应完成后的离心上清pH是否在8.0左右?有时由于溶液III配置的问题，会出现溶液III反应后离心的上清pH与8.0偏差较大的现象，这会降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差过大也会导致水相和平衡酚互溶。 使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切开? 参考见解：
1、确认酶的有效性。
2、平衡酚是否被氧化(正常是黄色，而氧化后是棕色的)。
3、是否不小心吸入了痕量的酚。
4、乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分(残留的盐类会影响酶切)。
5、乙醇漂洗后是否完全干燥(残留的乙醇会影响酶切)。
碱裂解法提取的质粒DNA进行琼脂糖电泳进行鉴定时，看到的三条带分别是什么? 参考见解：碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，得到的三条带是以电泳速度的快慢排序的，分别是超螺旋、开环和复制中间体(即没有复制完全的两个质粒连在了一起)。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 提取质粒中RNA没有去除? 可能是RNase失效或效率不高。参考见解：
1、更换RNase A，并保证其储存条件是正确的
2、手工提取质粒的，可单独增加一步去除RNA的步骤，溶液III反应后，在离心的上清中加RNase，室温下去除RNA 10min～30min(需要保证RNase A是经过失活DNase的)，同时较高温度(如50℃)会更加快速完全的去除RNA，经验所得经过高温处理的质粒质量不是很高。
提取的质粒电泳后，为连续的一片火箭状? 参考见解：
1、质粒如果盐离子多，会有走胶变形的现象，如果提到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。
2、当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。
3、可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚-氯仿处理一下再酶切，若有改善，则为宿主菌影响。转化到其它宿主菌再切。
4、 NaOH的浓度过高，会出现火箭状的结果。
用碱裂解法提取质粒，裂解5分钟，没有用酚 / 氯仿抽提，最后用灭菌水溶解质粒DNA15min。双酶切后跑胶一条带都没有，原因是什么? 参考见解：
1、溶解时间稍微短了点，但是根据各个实验室RNase不同，这个条件是不同的。在溶解的过程要涡旋处理促进溶解。
2、确认一下酶切过程中是不是有DNA酶的污染，比如酶切体系的Buffer或者是水，特别是水中;其次是酶切体系的问题;建议再把提取的产物用70%酒精重新洗涤一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。
3、也可能在用乙醇洗时把质粒倒掉了。
4、没有用RNase消化，不要用放久的 RNase否则会有DNA酶的污染;
5、在没有进行酶切时,把所提的质粒跑一下核酸电泳看看,如果是提核酸的问题那这一步电泳结果应该没有大于三千的条带,这样可以先排除核酸提取的问题. 若是没有酶切时间过长等其他问题的话可以那可以检查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的问题，建议将超纯水换成TE。
用碱裂解法提取的质粒,取3ul转化感受态大肠杆菌涂amp抗性平板，却出现阳性克隆较少(含绿色荧光蛋白，阳性克隆应该显绿色，在紫外灯下非常明显，就几十个菌落)大部分菌落不发绿，这些菌落比发绿的菌落小一些的现象，为什么? 参考见解：
1、做一次阴性对照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生长,说明amp过期,一般这种情况不多见。一般粉末状的amp不容易失效,如果amp有效的话,可以配制远高于标准的浓度,如果细菌耐药的话,也能生长良好,如不耐药,则放置数天仍不见细菌生长。
2、拿阴性和阳性的细菌各取数个放于高浓度的amp液体培养基中,如能生长,说明空白菌中带有耐药菌,建议换菌.
3、提质粒的菌受污染了，重新划线挑单克隆。
培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒?
参考见解：如果是氨苄抗性的，有可能是质粒丢失造成的。主要是培养时间较长，导致培养基中的beta-内酰胺酶过多，作用时间过长，同时培养基pH值降低，氨苄青霉素失活，从而使无质粒的菌株大量增殖。解决的办法：可以添加葡萄糖，缩短培养时间，改用羧苄青霉素。|||谢谢楼主,还有什么专题也要贴出来啊!|||谢谢分享
到一个小tips。转帖过来和菜鸟分享。大虾凭手感就可以了,我们还是要学学的,受益匪浅
1.溶液I—溶菌液：
溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：(1)螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基);(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2.溶液II-NaOH-SDS液：
NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH>12或pH<3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-„R+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰。
3. 溶液III--3mol/L NaAc(pH4.8)溶液：
NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
4.为什么用无水乙醇沉淀DNA?
用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。
5.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L? 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。
6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理?
加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。
7.为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液?
在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa=7.2)和硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。
8.如何选择聚乙二醇(6000)的浓度来沉淀DNA?
采用PEG(6000)沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1%左右，小分子所需PEG浓度高达20%。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30% PEG，其最终PEG浓度为12%。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。
9.抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好?
酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10%～15%的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合(1:1)使用。
10.为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵?
在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1(不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成)，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
11.为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚?呈粉红色的酚可否使用?如何保存酚不被空气氧化?
因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下(pH5～7)，RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。
保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1%。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或-20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。
第五篇：公文格式中常见问题解析
公文格式中常出现的不规范现象
(一)发文字号标注不规范。有的单位发文字号的年份用圆括号“()”括入，而不是用规范的六角括号“„‟”。对于字号和字体，有的用小3号;有的用小标宋体字，有的用楷体，也有的用黑体。有些公文序号出现编虚位(即001)， “××文„2008‟001号”等不规范格式。
(二)文种使用不当。文种是指国家行政机关公文的种类。2001年1月1日起施行的《国家行政机关公文处理办法》明确公文种类有13类，即：命令(令)、决定、公告、通告、通知、通报、议案、报告、请示、批复、意见、函、会议纪要。即各单位产生的公文不应该出现这13类公文以外的文种，错用文种不仅使公文失去应有的严肃性，还严重影响行文的作用和效率。文种方面存在的问题主要有三个方面：一是生造文种。比如《关于解决办公用房的申请》。很显然，申请不是规范的文种，因此应改成“请示”。二是混用文种。如《××局关于购买办公设备经费的请示报告》，将“请示”和“报告”两种文种混用。三是错用文种。最常见的错误是该用“请示” 的用了“报告” 该用“报告” 的用了“请示”， “请示”和“报告”是有严格区别的：“请示”是办件，是需要批复的;“报告”是阅件，不需要批复。如果错把“请示”用成了“报告”，会导致请示的事项得不到及时答复或得不到答复，从而影响了事情的办理。
(三)公文标题不规范。常见的问题：一是字体字号不规范，有用黑体的，有用宋体加黑的;有用二号字的，也有用小二号字的。《国家行政机关公文格式》中规定公文标题用2号小标宋体字。二是标题中滥用书名号等标点符号，规范的做法是除法规、规章名称加书名号外，标题中一般不加书名号。三是标题冗长繁琐。“事由”概括得不简要，转发(批转)性文件，标题照搬照抄，层层照转，一个词组套一个词组。四是回行时词意不完整，排列不对称，间距不恰当。
(四)引用文号不规范。比如先引文号后引标题，有的只引文号不引标题，有的只引标题不引文号。例如，“根据×××发„2008‟1号文《关于×××的通知》”，其引用文号的方法不符合规定，正确的引用方式应为“根据市政府《关于×××的通知》(×××发„2008‟1号)”。
(五)结构层次序数使用不规范。公文中的数字，除成文日期、部分结构层次序数和在词、词组、惯用语、缩略语、具有修辞色彩语句中作为词素的数字必须使用汉字外，应当使用阿拉伯数字。规范的结构层次序数要求，第一层为“
一、”，第二层为“
(一)”，第三层为“1.”，第四层为“(1)”。而在使用中常出现的问题：一是层次顺序颠倒，即下位序数与上位序数倒臵;二是层次跳跃，或在“
(一)”“(1)”后加顿号，写成“
(一)、”或“(1)、”等。
(六)成文日期标识不规范。常出现的问题：一是标注位臵距正文太远或太近，以至于印章距正文太远或盖压正文。成文日期与正文的距离要根据印章的大小而定，标准是印章
盖在成文日期上，上距正文不到1行的空白。二是把拟文日期作为成文日期。三是把修改日期或送签日期作为成文日期。四是联合行文主办机关签发日期作为成文日期。成文日期应以单位负责人签发的日期为准，联合行文的以最后签发机关负责人的签发日期为准。成文日期使用汉字并标全年、月、日。
(七)印章加盖不规范。印章是公文制发机关对公文负责的凭证，必须规范使用。常出现的不规范现象有：一是无印章。二是印章加盖歪斜。三是印章未居中下压成文时间。四是印章盖在正文上或距正文太远。印章正确的加盖位臵：印章上弧距正文2mm—4mm。当公文排版后所剩空白处不能容下印章位臵时，采取调整行距、字距的措施加以解决，务使印章与正文同处一面，不得采取标识“此页无正文”的方法解决。
单一机关制发的公文在落款处不署发文机关名称，只标识成文日期。成文日期右空4字;加盖印章应上距正文1行之内，端正、居中下压成文时间。当印章下弧无文字时，采用下套方式，即仅以下弧压在成文日期上;当印章下弧有文字时，采用中套方式，即印章中心线压在成文日期上。
当联合行文需加盖两个印章时，应将成文日期拉开，左右各空7字;主办机关印章在前，两个印章均压成文日期，要排列整齐，互不相交或相切，相距不超过3mm。
当联合行文需加盖3个以上印章时，主办机关印章在前，每排最多排3个印章，两端不得超出版心;最后一排如余一
个或两个印章，要居中排布;印章之间互不相交或相切;在最后一排印章之下右空2字标识成文时间。
(八)附件标注不规范。附件一般在正文之下空一行标识，附件名称后不加标点。常见的问题：一是没有与正文空开一行。二是在附件名称后加分号或句号等标点附号。三是附件标注的顺序与附件的顺序不一致，没有在附件左上角标明“附件”或者“附件×”字样。四是附件标注回行时顶行写，正确的写法是与附件序号后的文字对齐。五是附件不全，或标注了附件但没有一并报送。
(九)附注标注不规范。公文如有需要说明的事项要标识附注，如请示需标识联系人、联系电话等。常见的问题是请示没有标识附注，或者是附注标识的位臵不规范。联系人和联系电话标注位臵应在落款和版记之间的适当位臵，空两格加括号，中间用分号隔开。
(十)版记不规范。一是没有版记。二是版记位臵不对。三是主题词字体不对，主题词、词目均用黑体，且词目之间空格不均。规范的标识“主题词”三字用黑体，词目用小标宋体3号字体，词目间空一字。四是抄送机关标识不规范，常见的问题是将“抄报”和“抄送”分开，而不是统一为“抄送”，再有就是最后一个抄送机关不标句号。抄送机关之间应用逗号分开，最后一个抄送机关应标句号。五是印发机关和印发日期标注不对，印发机关和印发日期在抄送机关之下，印发机关左空一字，印发日期右空一字。但有的单位将二者左右顶格，有的空格太多。
(十一)没有代拟稿。凡需要以政府办名义上报下发文件的请示，一定要有代拟稿，有些单位没有代拟稿，有些单位拟好了稿不与请示一并上报。
(十二)公文中有错字、漏字、别字等硬伤。