[顶空气相色谱在药物检测中的应用]气相色谱顶空进样

海 南 大 学

课程论文

题 目：顶空气相色谱在药物研究的应用

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完成日期： [1**********]018 潘成凯 09级 材料与化工学院 生物工程系 生物工程 赵富春老师 2012 年 12 月 26 日

顶空气相色谱在药物研究的应用

09生工 潘成凯 [1**********]018

摘要:

关键字：

顶空气相色谱分析法是对液体或固体试样中的挥发性成分进行分析的最有效方法，是色谱分析的一种特殊形式，这一方法从气相色谱仪角度讲．是一种进样系统，即“顶空进样系统”。顶空进样就是样品在一密闭的恒温系统中，挥发组分气液（气固）两相达到平衡时，从上部空间取样，然后用气相色谱分析法进行测定。根据取样和进样方式的不同，顶空分析有静态分析和动态分析[1]。静态顶空是指将样品密封在顶空瓶子中，在一定的温度下加热，使得气液（固）之间达到气液平衡，然后取气相部分进入GC 检测。根据一次的检测结果进而确定待检测样品中挥发性成分的含量。如果进行多次取样，直至样品中挥发性组分完全萃取出来，这就是动态顶空GC 。静态顶空气相色谱简单便宜，而动态顶空气相色谱价格昂贵，不易操作【2】。

一、顶空气相色谱简介

1.1原理

顶空气相色谱利用液(固) 体中的挥发性组分i 在密闭恒温系统中达平衡后，气相和液(固) 相中挥发性组分比值恒定的原理，对平衡后液(固) 体上部的蒸气进行气相色谱分析。顶空瓶中试样上面的蒸汽压相当低时，峰面积Ai 的大小与试样上面的气相中挥发性组分i 的蒸汽压pi

成正比，在真实体系中，当系统达到平衡时，Ai=fi*pi=ki*xi（fi 为校正因子，pi 为i 的饱和蒸汽压，xi 为组分i 的摩尔分数），通过顶空分析，可确定试样中待测组分的含量【3】。

静态顶空气相色谱是将适量样品密封在留有充分空间的容器中，在一定温度下放置一段时间使气液（或气固）两相达到平衡，取容器上方的气体进行G C 分析。按达到气液（或气固）平衡的次数可分为一次顶空进样法和多次顶空进样法。按仪器模式可分为顶空气体直接进样模式、平衡加压采样模式和加压定容采样进样模式【4】。动态顶空气相色谱是在未达到气液平衡状况下进行多次取样，直至样品的挥发性组分完全萃取出来为止，因此又称气相连续萃取。常用的方法是向样品中不断通入惰性气体（气体萃取剂），挥发性成分即随萃取气体从样品溢出，然后由吸附装置（捕集器）收集，解吸后进入G C 仪分析，这种动态顶空GC 通常称为吹扫- 捕集顶空气相。动态顶空分析根据捕集模式可以分为吸附剂捕集模式和冷阱捕集模式[5]。

1.2仪器构造及部件 顶空气相色谱仪具有一般色谱仪的结构，在进样系统有自己独特的一面，其由载气系统、进样系统、分离柱、检测系统和温度控制系统5部分组成，载气系统主要作用是使样品能顺利进入分离柱，进样系统主要是负责将样品汽化，分离柱是色谱的核心部件，决定了色谱的分离性能，检测系统用于对样品进行检测并转化为信息进行放大，温度控制系统则对汽化室、分离室、检测室进行温度的控制。顶空气相色

谱的进样系统需要一个恒温浴的过程，使样品汽化充满取样品，普通的气相色谱是用进样针进样，进样体积在ul 级别，样品为液体；顶空进样进样体积在ml 级别，进入气相色谱的为气体。【6】

1.3检测方法、条件及其发展特点

顶空气相色谱顶空分析源于分析固体或液体顶部蒸气相中的有机挥发性物质，其出现早于气相色谱法。1939年Harger 等对水相中醇含量的测定为该方法的雏形。到1958年，顶空气相色谱作为一种独立的样品处理技术和气相色谱联用进行挥发物和半挥发物的分析方法出现报道【7】。早期恒温浴的温度在120℃到150℃，现在已经升到190℃甚至更高，扩大了顶空进样器的应用范围。现在适合顶空气相色谱法的检测器有火焰离子化检测器(FID)、热导检测器(TCD)、氮磷检测器 、火焰光度检测器、电子捕获检测器、质谱检测器等。

二、顶空气相色谱在药物研究的应用

1、顶空气相色谱在中药物质分析中的应用

翁雪香等【8】利用顶空固相微萃取技术富集筒篙挥发性化合物，用手动的固相微萃取装置顶空萃取30 min, 萃取温度为60℃。提取物在GC 进样口( 270℃ ) 脱附2 min, 载气为氦气，检测器温度280℃，然后进行GC- MS 检测分析。经气-质联用仪分析，共分离鉴定出25种化合物，大约占总峰面积99. 8%，主要的化合物有蒎烯38.6%、罗勒烯19.3%、2-己烯醛9.0%，1，6，10-十五碳三烯6.4%、乙酸冰片酯

4.30%、大根香叶烯2.7%和金合欢烯1.1%和2-乙基-4丁醇8%等。用气相顶空技术得到的结果，与溶剂提取法得到的结果相比，是一种测

定茼蒿易挥发性成分简单、迅速、有效的方法。

薛健等【9】采用顶空吹扫法进行采样，在气相色谱220℃时进样，进样量为2.0微升，分流比1：50，检测室温度200℃的条件下进行测定，结果检测出的100多个成分中有30多种化合物相同，而相差2倍以上的有15种化合物，相差5倍以上的有4种化合物，而其余成分不同，为顶空色谱在道地与非道地药材的区别上提供了一定的理论指导。

魏宁漪【10】等利用顶空进样和固相微萃取进样，将40mg 对照样品置于20ml 顶空样品瓶中，加热温度为120℃，时间0.5小时，顶空时进样2ml ，在270℃时进行进样，载气为氦气，流速1ml/min，进行气相色谱检测，结果显示，可以检测出其中的樟脑、龙脑、己酸、苯酚、辛酸等掺假成分。

徐娟华【11】采用顶空气相谱法测定鸡肝散中7种挥发油成分含量。以乙酸乙酯为溶剂, 顶空条件为平衡温度90℃，时间为30min ，气体1ml 自动进样，气相采用程序升温法: 初始温度60℃ , 以30℃/min 升至90℃ , 再以5℃/min升至180℃ ; 进样口温度200℃ , 检测器温度240℃。7种成分能较好分离, a- 蒎烯、B- 蒎烯、L, 8- 桉叶醚、樟脑、芳樟醇、乙酸龙脑酯和龙脑平均回收率分别为96. 6%、97.0%、

97. 8%、99.9%、96.5%、97.4%、97.1%.由此可知，顶空气相色谱能够很好的对中药材中的挥发油进行检测。

于生等[22]于150℃ 对药材粉末加热60m in 后取顶空气体0.5ml, 进样口200℃，FID220℃检测。通过对10批猫爪草药材色谱图的统计分

析, 标定了12个共有峰。认为此方法简便, 稳定性、重现性好, 具有可操作性。

陈建伟 [ 23] 在顶空温度95℃，平衡10 min 后进入色谱，进样口温度为180℃，FID 在280℃进行检测，分析结果发现3种中药的顶空气相色谱特征指纹图各异, 贮藏4年的牡丹皮仅含微量的丹皮酚。顶空气相色谱法在鉴定芳香类中药的品质及其质量监控方面, 具有简便、快速、准确及专属性强的优点。

2、顶空气相色谱在药物溶剂残留分析中的应用

梁祈【12】等采用顶空气相色谱法测定了头抱氨节中有机残留溶剂甲醇的含量，用0.5 m ol/L氢氧化钠溶液为溶剂制备供试品溶液, 顶空热平衡温度: 80 ℃ , 采样针温度: 105 ℃ , 传输管温度: 110 ℃ , 热平衡时间: 30 min, 压力平衡时间: 0. 3 min, 进样时间: 0. 03 min。在120℃时进样，采用FID 检测器，温度为280℃。结果显示，测定结果准确、可靠，可作为头抱氨节中甲醇残留的检测方法。

黄勇【13】等用顶空气相色谱法同时测定赤芍提取物中2种残留有机

溶剂，顶空平衡温度为70℃，平衡时间40 m in。色谱柱温60℃，载气为氦气，进样口温度为220℃，进样体积0.5ml ，得出提取物中乙醇、正丁醇残留测定结果, 含乙醇不得过1 000 μg /g, 正丁醇不得过20μg /g, 远低于ICH 规定0.5% ( 5 000ug /g)的限度要求。顶空进样避免了难挥发物质对色谱柱的污染以及一些不必要的干扰, 又增加了挥发性被分析物的灵敏度, 非常适合于挥发性有机溶剂残留分析。 魏晶晶等【14】利用顶空进样，结合毛细管色谱柱，对常用的在生产药物机制被过程中常用到的27种有机挥发性化合物进行测定，顶空条件为80℃恒温震荡30min ，以1：1的分流比进样，进样口温度为220℃，检测器温度300℃，结果显示分离度绝大多数均大于1.5，峰面积与浓度呈良好的线性关系，精密度良好。

何伟[15] 采用顶空气相色谱法测定银杏叶提取物中有机溶剂乙醇的残留量。采用CP- 624色谱柱, 载气为氮气, 柱温采取程序升温的方法; FID 检测器温度250℃ ; 进样口温度180℃ 。结果显示乙醇在20. 6 ~412.0μg /mL范围内呈良好的线性关系, r= 0. 9996平均回收率为99.85%, RSD 为1.62%, 最低检测限为13ng 。认为该方法简单、灵敏、准确, 可用于银杏叶提取物中乙醇残留量的测定。

刘敬兰等[16]利用顶空气相色谱法测定了维生素B12 中丙酮溶剂的残留量, 其色谱条件为10 % 二硝基对苯二甲酸封端的聚乙二醇20 M (FFAP 2 m x 3 m m ) 不锈钢柱, 柱温80 ℃ , 气化室及检测器温度为150 ℃ ; 载气流量5 0 m L/min。通过试验发现其最佳平衡时间为60 m in , 最佳平衡温度为60 ℃ , 在0~300 ug 的范围内峰面积和丙酮

含量间呈现良好的线性关系。

潘雪萍【17】采用顶空气相色谱法测定盐酸托泊替康中的残留有机溶剂。通过实验发现，顶空的最佳条件为温度80℃，最佳平衡时间为30min ，气相的进样口温度为250℃，流速５．５ｍＬ／ｍｉｎ，分流比为１∶１，柱温箱温度５５℃，检测器温度２５０℃。测定３批样品，均未检出乙腈、乙酸乙酯和二氧六环，检出了甲醇和丙酮，各残留量符合要求。方法学验证结果表明，该方法简单、快捷、灵敏， 可有效用于该药有机溶剂残留量的控制。

张宏等[ 26] 测定水飞蓟提取物中的正己烷和醋酸乙酯的残留量。试验采用FFAT ( 2- 硝基对苯二甲酸封端的聚乙二醇20M 柱) 石英毛细管柱, 程序升温方式, 顶空条件为平衡温度为130 e , 平衡时间30 m in, 测定结果表明水飞蓟提取物中两种溶剂残留量均符合要求。

王腾等[ 30] 采用HP- 5色谱柱, 柱温80 ℃ , 顶空瓶加热温度80 ℃ , 平衡15 m in, 以正丁醇为内标测定注射用银杏叶( 冻干) 中甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯残留量。该方法线性良好, 精密度、重现性RSD 均小于5%, 平均回收率在93. 06% ~ 113. 78%, 四种溶剂残留量均符合要求。

3、顶空气相色谱法在中药外源性杂质引入的检测

廖远熹等[ 18] 采用静态顶空气相色谱- 质谱联用技术鉴别市售柴胡是否经硫黄熏制。将2g 样品置于10ml 顶空瓶，试验采用HP- 5MS毛细管色谱柱, 程序升温方式, 进样口温度为200℃，以50比1的分流比进样，以氦气为载气, 顶空温度120 ℃, 预热30m in。结果表明: 与

未经硫黄熏制的阴性样品比较, 9种市售柴胡中有7种经过了不同程度的熏制, 该方法可广泛应用于中药材硫黄的检出。

4、顶空气相色谱法测定使用大孔吸附树脂后的残留物

袁海龙【19】等采用顶空进样方式, 氢火焰( FID)检测器, 利用程序升温方式, 以氦气为载气, 顶空温度为60 ℃ , 加热时间为30 m in, 气相色谱进样口温度为200℃，检测器温度240℃， 用以测定经D101大孔吸附树脂分离的茵陈蒿有效部位中可能含有的正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、二苯乙烯等残留物及裂解产物。结果表明该中药有效部位中未检测出以上7种残留物. 采用顶空进样, 取得了很好的效果。

邓海星【20】等采用顶空毛细管气相色谱法测定胡黄连提取物中大孔树脂残留物，在80℃下平衡40 m in, 采用顶空进样方式，检测器为氢火焰离子化检测器, 温度270℃ ; 进样器250℃ , 以5比1的分流比进样。结果显示7种残留物的峰面积与浓度的线性关系良好。 姚干等[21] 用顶空温度85 ℃ , 以二甲亚砜为溶剂, 对采用HPD450大孔吸附树脂分离纯化所得的栀子提取物中可能含有的正己烷、苯、正庚烷、甲苯等残留物进行测定; 再用顶空温度85 e , 以1% 甲醇为溶剂, 测定栀子提取物中可能含有的二甲苯、苯乙烯、1, 4- 二乙基苯和1, 2- 二乙基苯等残留物。结果表明, 三批栀子提取物均未检出上述8种残留物, 最低检测限在50ng /m l以下。

许勇【24】等采用顶空进样毛细管气相色谱法测定灯盏花素提取物中

大孔树脂有机溶剂残留物，在顶空温度90℃下平衡30min ，进样口240℃，300℃FID 检测，结果显示，待测物正己烷、苯、甲苯、对 二甲苯、邻二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯、二乙烯苯与内标物正丁醇获得了较好的分离。8 种有机残留物，结果均未检出。

李丽敏【25】等用顶空温度95℃平衡30min ，气相进样口温度240℃，柱温60℃，检测器温度为300℃对三七叶苷中大孔树脂有机溶剂残留物进行检测，结果显示，没有残留物剩余。此法简单高效，可作为测定方法。

王焱[27]在平衡温度85℃下加热55min ，进样口温度180℃，FID 检测器180℃，柱温40℃，载气为氮气对加参片中大孔树脂有机残留溶剂。结果表明各残留溶剂均未检出，符合限度要求。该方法适用于中药复方制剂加参片中大孔树脂残留溶剂的控制。

另外, 邹亮等[ 28] 测定了苦荞麦总黄酮提取物中可能由AB - 8大孔树脂中残留的正己烷、苯、甲苯、对二甲苯、间二甲苯、邻二甲苯、乙苯和苯乙烯。杨玲等[ 29 ] 测定黄芩提取物中可能含有的D-101大孔吸附树脂带来的正己烷、苯、甲苯、二甲苯、二乙苯、苯乙烯、二乙烯苯等残留物。

三、前景

顶空气相色谱法是一种对药物成分检测的快速而简便的分析方法, 该方法具有较高的灵敏度和分析速度, 对分析人员和环境危害小, 操作简便, 是一种符合绿色分析化学要求的分析手段。为了保证药品的安全性, 中药材提取物中有机溶剂残留量的测定就成为研究者关注 的问题, 也是药品质量的检测的重点关注的问题, 对这些溶剂的测定在《中国药典》2 005 版附录作原则性规定。随着分析仪器的发展和分析技术的提高, 顶空气相色谱在药物分析中的应用将会越来越广泛。

参考文献：

【1】[1]Kolb B,Ettre L S.Static headspace-gas chromatography:theory and practice[M].New Jersey:John Wiley&Sons,2006

【2】张军 车海先 ，浅议顶空气相色谱【J 】，食品安全导刊，2012

（5）：48

【3】刘志广，张华，李亚明. 仪器分析【M 】，大连：大连理工大学出版社，2007.101

[4] 王昊阳，郭寅龙，张正行，等. 顶空- 气相色谱法进展[J].分析测

试技术与仪器，2003，9（3）：129-135

【5】Kolb, Bruno. Headspace sampling with capillary columns [ J ] . J. Chromat ogr. , A, 1999, 842 ( 1 + 2)B163- 205

【6】中国药典2005年版二部【M 】，北京：化学工业出版社，2005:附录30-31

【7】BormL ，PirotteP ，BergerA GasChromatography(Amsterdam Symposium)in:DestyDH(Eiditor).Butterwroth，London:1958.310