斑点金免疫渗滤法快速诊断布鲁杆菌病的研究:布鲁杆菌病
万方数据
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乙肝患者及幽门螺杆菌感染者血清由浙江省医学科学院寄生虫病研究所诊断室提供。１．２方法
１．２．１固相膜的制备：用微量进样器吸取抗原点于硝酸纤维素膜上．自然干燥。
１．２．２胶体金的制备及胶体金蛋白的标记：按Ｆｒｅｎｓ枸橼酸钠还原法制备胶体金［６］。按Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ方法标记胶体金蛋白［７］。
１．２．３最佳实验条件的选择：对不同抗原点样量、不同血清量和不同金标记抗人ＩｇＧ结合物水平进行比较试验。抗原点样后用不同水平的吐温一２０封闭。１．２．４稳定性试验：将点样后的固相膜和金标记抗人ＩｇＧ结合物置４℃保存，每隔１个月取出测定１次。
１．２．５重现性试验：取布病患者血清２０份，健康人血清２０份，用ＤＩＧＦＡ先后重复测试３次。
１．２．６敏感性、特异性和交叉反应：用ＤＩＧＦＡ分别检测布病患者血清、健康人血清、肺结核患者、乙肝患者和幽门螺杆菌感染者血清。
１．２．７
ＤＩＧＦＡ操作方法：在吸附有抗原的小盒中央
孔膜上加洗涤液（ＰＢＳ含０．１％吐温一２０）２滴（１００斗１）；待渗入后，速加受检血清；待渗入后，速加洗涤液１滴（５０斗１）；待渗入后，速加胶体金标记抗体；待渗入后，速加洗涤液２滴（１００斗１）。观察结果，如在膜上显现红色斑点，结果为阳性，否则为阴性。２结果
２．１最佳实验条件的选择
２．１．１
固相膜抗原点样量确定：在固相膜上点样
１．２５、２．５０、５．００斗ｌ进行比较试验，结果显示点样量以２．５０斗ｌ为最适工作剂量。
２．１．２检测血清量的确定：分别用１２．５、２５．Ｏ、５０．０斗１血清量进行测试，６０例布病阳性患者血清，阳性符合率分别为９５％、１００％、１００％；６０例健康人血
清．阴性符合率分别为１００％、１００％、９７％。结果显示最佳血清量为２５．Ｏ¨ｌ。
２．１．３金标记抗人ＩｇＧ结合物水平确定：金标记抗人ＩｇＧ结合物以１．０、１．５、２．０、２．５、３．Ｏ倍稀释进行比较试验，结果显示以２．５倍稀释（加入量５０肛１）为最适水平。
２．２稳定性试验：将点样后的固相膜和金标记抗人ＩｇＧ结合物置４℃保存，每隔１个月取出测定１次。每次用布病患者血清和健康人血清各２０份，共测试３次．结果不变。
２．３重现性试验：ＤＩＧＦＡ先后重复检测布病患者血清和健康人血清各２０份，测定３次，结果一致。
万方数据
２．４敏感性、特异性和交叉反应：ＤＩＧＦＡ检测布病患者血清９６份，阳性率９８％，检测健康人血清９５份，阴性率１００％，其敏感性和特异性分别达到９８％和１００％：检测肺结核患者血清２６份、乙肝患者血清２０份及幽门螺杆菌感染者血清２６份，均为阴性，未发现与该３种患者血清有交叉反应。
３讨论
近年来．对布病的检测方法研究较多，ＥＬＩＳＡ法虽具有敏感性高、特异性强等优点，但操作烦琐、费时多，需要一定的仪器，在基层推广受到一定限制［８］：ＰＣＲ技术用于布病的诊断，因敏感性差，未能应用［９］。ＤＩＧＦＡ是近年发展起来的新标记技术，已广泛用于病毒、细菌及寄生虫病的免疫诊断ｍ］。
该研究结果显示：通过最佳实验条件选择的比较试验。确定合适的抗原、血清及胶体金标记蛋白的用量．建立起来的ＤＩＧＦＡ快速检测布病具有很好的重现性和稳定性：敏感性和特异性分别达到９８％和１００％：未发现与肺结核患者、乙肝患者及幽门螺杆菌感染者血清有交叉反应。
ＤＩＧＦＡ快速诊断布病，以硝酸纤维素膜为载体，胶体金标记蛋白为显示剂，抗原抗体通过渗滤发生反应，阳性结果在膜上显示红色斑点。方法快速、简便，测试过程１～２ｍｉｎ内完成，试剂敏感、特异、稳定，非常适合于布病的诊断及流行病学调查。
参
考
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（收稿日期：２００５．０８—２４）
（本文编辑：陈晶）
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