斑点金免疫渗滤法快速诊断布鲁杆菌病的研究:布鲁杆菌病
万方数据
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乙肝患者及幽门螺杆菌感染者血清由浙江省医学科学院寄生虫病研究所诊断室提供。1.2方法
1.2.1固相膜的制备:用微量进样器吸取抗原点于硝酸纤维素膜上.自然干燥。
1.2.2胶体金的制备及胶体金蛋白的标记:按Frens枸橼酸钠还原法制备胶体金[6]。按Horisberger方法标记胶体金蛋白[7]。
1.2.3最佳实验条件的选择:对不同抗原点样量、不同血清量和不同金标记抗人IgG结合物水平进行比较试验。抗原点样后用不同水平的吐温一20封闭。1.2.4稳定性试验:将点样后的固相膜和金标记抗人IgG结合物置4℃保存,每隔1个月取出测定1次。
1.2.5重现性试验:取布病患者血清20份,健康人血清20份,用DIGFA先后重复测试3次。
1.2.6敏感性、特异性和交叉反应:用DIGFA分别检测布病患者血清、健康人血清、肺结核患者、乙肝患者和幽门螺杆菌感染者血清。
1.2.7
DIGFA操作方法:在吸附有抗原的小盒中央
孔膜上加洗涤液(PBS含0.1%吐温一20)2滴(100斗1);待渗入后,速加受检血清;待渗入后,速加洗涤液1滴(50斗1);待渗入后,速加胶体金标记抗体;待渗入后,速加洗涤液2滴(100斗1)。观察结果,如在膜上显现红色斑点,结果为阳性,否则为阴性。2结果
2.1最佳实验条件的选择
2.1.1
固相膜抗原点样量确定:在固相膜上点样
1.25、2.50、5.00斗l进行比较试验,结果显示点样量以2.50斗l为最适工作剂量。
2.1.2检测血清量的确定:分别用12.5、25.O、50.0斗1血清量进行测试,60例布病阳性患者血清,阳性符合率分别为95%、100%、100%;60例健康人血
清.阴性符合率分别为100%、100%、97%。结果显示最佳血清量为25.O¨l。
2.1.3金标记抗人IgG结合物水平确定:金标记抗人IgG结合物以1.0、1.5、2.0、2.5、3.O倍稀释进行比较试验,结果显示以2.5倍稀释(加入量50肛1)为最适水平。
2.2稳定性试验:将点样后的固相膜和金标记抗人IgG结合物置4℃保存,每隔1个月取出测定1次。每次用布病患者血清和健康人血清各20份,共测试3次.结果不变。
2.3重现性试验:DIGFA先后重复检测布病患者血清和健康人血清各20份,测定3次,结果一致。
万方数据
2.4敏感性、特异性和交叉反应:DIGFA检测布病患者血清96份,阳性率98%,检测健康人血清95份,阴性率100%,其敏感性和特异性分别达到98%和100%:检测肺结核患者血清26份、乙肝患者血清20份及幽门螺杆菌感染者血清26份,均为阴性,未发现与该3种患者血清有交叉反应。
3讨论
近年来.对布病的检测方法研究较多,ELISA法虽具有敏感性高、特异性强等优点,但操作烦琐、费时多,需要一定的仪器,在基层推广受到一定限制[8]:PCR技术用于布病的诊断,因敏感性差,未能应用[9]。DIGFA是近年发展起来的新标记技术,已广泛用于病毒、细菌及寄生虫病的免疫诊断m]。
该研究结果显示:通过最佳实验条件选择的比较试验。确定合适的抗原、血清及胶体金标记蛋白的用量.建立起来的DIGFA快速检测布病具有很好的重现性和稳定性:敏感性和特异性分别达到98%和100%:未发现与肺结核患者、乙肝患者及幽门螺杆菌感染者血清有交叉反应。
DIGFA快速诊断布病,以硝酸纤维素膜为载体,胶体金标记蛋白为显示剂,抗原抗体通过渗滤发生反应,阳性结果在膜上显示红色斑点。方法快速、简便,测试过程1~2min内完成,试剂敏感、特异、稳定,非常适合于布病的诊断及流行病学调查。
参
考
文献
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(收稿日期:2005.08—24)
(本文编辑:陈晶)